RNA编辑治疗杜氏肌营养不良症

大约10%的单基因疾病是由无义点突变引起的，无义点突变产生提前终止密码子(Premature termination codons, PTCs)，导致蛋白质截短和突变mRNAs的无义介导的衰变，其中约50%可以通过腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors, ABEs)的A-G转换逆转。具体而言，A-G转换可以将PTC转换为非终止密码子来恢复蛋白质表达，从而实现PTCs通读。

2022年12月13日，The Journal of Clinical Investigation期刊在线发表了题为Mini-dCas13X-mediated RNA editing restores dystrophin expression in a humanized mouse model of Duchenne muscular dystrophy 的研究论文，该研究由临港实验室、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、上海脑科学与类脑研究中心、辉大基因及福建医科大学等多单位合作完成。该研究表明，Mini-dCas13x介导的RNA碱基编辑技术 (Mini-dCas13x derived RNA base edtor, mxABE)可以高效恢复人源化杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）小鼠模型中肌萎缩蛋白 (Dystrophin) 的表达，Mini-dCas13x编辑技术由杨辉与胥春龙研究员等研究者共同开发，并于2021年在Nature Methods杂志报道。

虽然来源于切割酶Cas9的碱基编辑器，已被证明能纠正一些单基因突变，但这些蛋白质通常太大，不能通过单个AAV载体(最大载量仅为4.7kb)进行有效的体内递送。相对其他大尺寸碱基编辑工具，RNA碱基编辑技术具备尺寸较小、可逆性和灵活性等特点已经成为当前研究的热点，产生了mxABE、REPAIR、RESTORE、LEAPER等编辑技术。最近的一项研究表明，RNA碱基编辑器确实可以恢复无义突变终止的蛋白表达。然而该研究仅实现了有限的功能性蛋白表达，而且在治疗的小鼠中并没有观察到受损肌肉功能的缓解和运功功能的恢复。尽管如此，这些研究表明RNA编辑系统可以靶向无义突变诱导的PTCs，意味着RNA编辑可能是治疗单基因疾病更安全和有效的方法。

在单基因神经肌肉疾病中，杜氏肌营养不良症(DMD)是第二大常见的遗传性肌肉疾病。估计每3500~5000名新生儿中就有1名受影响。目前临床上仍无有效治疗手段，绝大多数患者预后差，社会负担重。糖皮质激素作为目前指南推荐的唯一具有循证医学证据的药物，虽然适用于所有突变类型的DMD患者，但仅能在一定程度上延缓病情进展，不能逆转DMD的灾难性病程。据统计，60-70%的DMD疾病是由DMD基因外显子缺失引起的。然而，约10%的病例由无义点突变导致的，这些突变在DMD中引入了PTC（其中40%是UAG，39%是UGA，21%是UAA PTCs）。由于DMD是由缺乏功能性dystrophin蛋白引起的，因此从基因或转录水平上恢复dystrophin蛋白的功能或表达是最有效、最根本的治疗方法。

前期，合作单位福建医科大学附属第一医院收治一名进行性对称性肌无力、腓肠肌假性肥大、血清肌酸肌酶增高和肌电图呈肌源性损害等症状的患者，通过全外显子组测序确定其DMD基因发生c.4174C>T (p.Gln1392*)的无义点突变，随后本研究团队通过制备人源化DMD小鼠进一步验证了该突变的致病性。由于大部分细胞不表达DMD基因，作者利用携带突变位点的外源性报告载体，对相关DMD无义突变位进行mxABE系统筛选，并通过肌肉定点注射单个腺相关病毒包装的mxABE编辑工具，发现在人源化DMD模型体内可实现84%的A-to-G编辑效率，这与之前使用其他RNA编辑方式的研究报告的效率相比至少高出20倍。

图1 AAV全身递送mxABE 6周后检测人源化DMD模型小鼠的治疗效果  

A.心肌、膈肌和胫骨前肌mRNA A to I碱基编辑效率；B. 心肌、膈肌和胫骨前肌的dystrophin蛋白Western blot分析；

C. 心肌、膈肌和胫骨前肌的免疫荧光染色；D. 野生型对照、DMD小鼠模型及不同治疗组前肢抓力检测；

E. 野生型对照、DMD小鼠模型及不同治疗组的疲劳测试；F. 野生型对照、DMD小鼠模型及不同治疗组的转棒测试。

为了探索治愈DMD患者的可能性，作者通过AAV病毒将mxABE递送至人源化动物的全身肌肉组织，验证其蛋白恢复水平和功能性恢复情况。发现通过AAV全身给药可分别将膈肌、胫骨前肌和心肌中的dystrophin蛋白表达平均恢复到WT水平的37%、6%和54%，并明显恢复了小鼠运动功能。总之，本研究利用前期开发的编辑效率更高、体积更小的mxABE工具成功实现人源化DMD小鼠dystrophin蛋白表达，并明显恢复其运动功能。本项目利用先进的基因编辑技术在动物体内首次完成了RNA编辑治疗杜氏肌营养不良症方法的安全性和有效性评估，为治疗其他相关遗传性疾病提供新的思路和方法。

这项开创性研究由临港实验室胥春龙研究团队联合中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究员、福建医科大学王柠教授和陈万金教授团队共同合作完成。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心李国玲、肖庆全和杨栋博士、临港实验室李智方博士与福建医科大学金铭博士为共同第一作者。辉大基因王兴博士、王豪强和施霖宇博士对该研究亦有重要贡献。