Nature Neuroscience丨临港实验室合作利用RNA编辑技术治疗MECP2重复突变导致的神经系统罕见病

甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）由剂量敏感的MECP2基因编码，是维持大脑功能正常的关键表观遗传调控因子。当其功能受损时，会导致儿童罹患两种罕见的X连锁神经发育障碍。MECP2基因的失能突变会引发雷特综合征（Rett syndrome，RTT），而包含MECP2的X染色体位点Xq28的重复或三倍体会导致MECP2重复综合征（MECP2 Duplication Syndrome，MDS），这表明大脑功能中MeCP2水平的正确性至关重要。MDS的主要特征包括婴儿期肌张力低下、智力障碍、焦虑、运动功能障碍、癫痫和反复呼吸道感染。由于临床症状往往会随年龄增长而加重，MDS给患者及其照料者带来沉重的负担。大约一半的患者无法存活至25岁以上，通常死于呼吸道感染。目前尚无针对MDS疾病的获批疗法，现有治疗仅限于对症管理和支持性护理，因此，MDS的治疗存在巨大的未满足医疗需求。

    2024年12月12日，临港实验室胥春龙团队与辉大基因/中国科学院上海药物研究所杨辉团队在Nature Neuroscience发表题为An RNA editing strategy rescues gene duplication in a mouse model ofMECP2duplication syndrome and nonhuman primates 的研究论文。该研究通过单次侧脑室注射方式，使用单个腺相关病毒 (AAV) 载体递送辉大基因专有的高保真、高活性的RNA编辑工具hfCas13Y及MECP2基因的引导RNA (gRNA)，在MDS小鼠模型和野生食蟹猴模型中实现了大脑内hfCas13Y和MECP2 gRNA的稳定、持久表达。同时大脑MECP2基因的表达被敲低至生理性可接受的水平，显著改善了人源化MDS小鼠的运动功能、焦虑抑郁样行为、学习和记忆能力、社交功能，并延长了生存时间。这一研究为后续临床试验提供了坚实的科学基础。目前，临床试验已正式启动（NCT06615206）。

    本研究旨在筛选高效且特异的RNA编辑工具和gRNA以高效降低MDS疾病中异常的MECP2高表达水平。研究人员基于前期工作自主发现的CRISPR-Cas13X/Y系统，通过蛋白质工程化改造开发了高保真、高活性的RNA编辑工具hfCas13Y。随后，在细胞系中针对人、猴、小鼠MECP2 mRNA的保守同源区域筛选出高效的gRNA，该gRNA可将MECP2 mRNA水平降低至90%以上，且未观察到明显的脱靶效应。为评估hfCas13Y-gMECP2对携带人源MECP2基因的MDS转基因小鼠模型（下称MDS小鼠）的治疗效果，研究人员将hfCas13Y-gMECP2包装于单个AAV载体中，并通过侧脑室注射，将不同剂量的AAV递送到新生的雄性MDS小鼠脑内。给药4周后，MDS小鼠大脑皮层、纹状体和海马组织中的MECP2 mRNA和蛋白水平均显著降低。最高剂量下AAV将MECP2表达水平降低至接近野生小鼠水平。免疫荧光染色和单细胞RNA测序结果进一步显示，在单个神经元水平上，最高剂量的AAV将大脑皮层中的MECP2表达降低至野生小鼠Mecp2表达水平的35-75%，达到有效治疗MDS且避免引发MECP2水平过低导致RTT的最佳范围。大脑皮层的RNA测序结果表明，给药4周和48周后，MDS小鼠大脑皮层中异常基因表达模式恢复至与类似健康小鼠状态。

    行为学评估显示，注射AAV 8周后，MDS小鼠的运动功能、焦虑抑郁样行为、社交行为及学习和记忆能力恢复至野生小鼠水平，并持续至26周。最高剂量下治疗后的MDS小鼠的生存时间显著延长。长期安全性评估证实，该剂量在MDS小鼠中未表现出安全性风险。此外， AAV-hfCas13Y-gMECP2在成年MDS小鼠中也表现出显著的疗效。

    最后为了验证AAV-hfCas13Y-gMECP2在降低食蟹猴大脑中MECP2表达水平的有效性，研究人员通过侧脑室注射的方式，将不同剂量的AAV-hfCas13Y-gMECP2递送到成年雄性食蟹猴大脑中。注射6-8周后，结果显示hfCas13Y在整个大脑中广泛分布，并呈现剂量依赖性。同时，不同剂量组的食蟹猴大脑中MECP2 mRNA的平均表达水平显示出下降低趋势，尤其在高剂量AAV给药组中，野生食蟹猴大脑内的MECP2 mRNA和蛋白表达均显著下降。以上结果表明，AAV-hfCas13Y-gMECP2能够有效降低非人灵长类动物大脑内的MECP2水平。

    此外，研究还检测了与MECP2下游调控相关的分子GDF11在高剂量AAV治疗后的变化。GDF11是一种潜在的MDS疾病生物标记物，在MDS中其表达水平升高，而在RTT中则降低。在本研究中，研究人员检测量了食蟹猴脑脊液中GDF11蛋白含量，发现高剂量AAV给药后，不同时间点脑脊液中GDF11蛋白水平均有所降低。这进一步支持了AAV-hfCas13Y-gMECP2在调节与MECP2相关的分子通路方面的潜力，并为其治疗MDS提供了更为广泛的机制基础。

    该研究由辉大基因/中国科学院上海药物研究所杨辉团队及临港实验室胥春龙团队共同完成，杨辉研究员、胥春龙研究员、辉大基因施霖宇博士、姚璇博士为本文的共同通讯作者，辉大基因研发中心杨栋博士、吴晓晴、段梦思、中科院上海药物所博士后姚依楠博士为本文的共同第一作者。